实验室操作培训

引物设计、合成

    本公司提供各种引物设计,引物合成我们是拿到专业的引物合成公司去做,请知悉。以下是关于引物设计的一些小知识:

 

    PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多,在大多数情况下,我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。设计的目的是在两个目标间取得平衡:扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理:

 

一、引物长度

    一般引物长度为18~30碱基。总的说来,决定引物退火温度(Tm值)最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

  • 在引物长度小于20bp时:[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
  • 在引物长度大于20bp时:62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

 

    另外有许多软件也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各有不同,因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应,使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。总的说来,每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍,这样,大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要,主要与反应效率有关。由于熵的原因,引物越长,它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

 

二、GC含量

    一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%,一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

 

三、退火温度

    退火温度需要比解链温度低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加;如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度,是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃~6℃不会影响PCR的产率,但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的,可以在55℃~75℃间变化。

 

四、 与靶DNA的错配

    当被扩增的靶DNA序列较大的时候,一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合,造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测,网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。选择Align two sequences (bl2seq),如下图。

 

 

五、引物末端

    引物3’端是延伸开始的地方,因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。

[返回]

  • Copyright© Ubiolab 2013,All Rights Reserved法律声明|合作伙伴|友情链接
  • 京ICP备13020635号-2