实验室操作培训

相对定量

 

    相对定量适用于基因芯片结果验证、miRNA表达量分析、siRNA效果验证等基因表达差异方面。绝对定量一般不需要构建标准品和标准曲线,采用2-ΔΔ Ct法进行计算。有荧光染料SYBR Green或TaqMan探针法两种技术手段去实现。

 

SYBR Green 染料法:

    SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料,SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号(图1),荧光信号与双链DNA分子数成正比,随着扩增产物增加而增加,荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。

图1 SYBR Green工作原理

 

TaqMan探针法:

    PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累,因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系(图2),从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

图2 TaqMan探针法原理

 

    一般情况下进行研究采用SYBR Green 方法,成本低,而进行长期研究或检测的时候通常用TaqMan探针方法,这种方法准确性和特异性更好。 

 

 

 

送样要求:

    基因信息,细胞≥107、组织≥300mg、血液≥1ml、基因组DNA或总RNA(体积≥20μl, 浓度≥500ng/μl)。

 

实验结果:

    引物和探针及序列,胶图,原始数据,数据分析结果及实验报告。

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