实验室操作培训

高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melt,HRM)

 HRM实验原理:

 

    高分辨率熔解(High Resolution Melt, HRM)是一种最新的在表观遗传学中检测 CpG 位点的一种新技术,主要是根据DNA序列的长度、GC含量、碱基互补性差异和特定饱和染料可以插入DNA双链中的特性,应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析,其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。由于每一段DNA都有其独特的序列,因而也就有了独特的熔解曲线形状,如同DNA指纹图谱一样,具有很高的特异性、稳定性和重复性。在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。

 

 HRM实验流程:

 

优点:

    1、不受碱基位点局限,同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点;

    2、敏感性高,待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡也可检测;

    3、成本低廉、时间少、误差小、高通量检测。

 

缺点:

    1、存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性;

    2、不能够精确检测甲基化的具体位点;

    3、对低水平的DNA甲基化敏感性低。

 

送样要求:
    1、组织样本:-20℃或-80℃低温冰箱中保存,液氮或者干冰运输;市内或短途运输可冰袋运输。若提供的材料为新鲜组织、血液细胞等生物材料,请提供足够提取2ug以上基因DNA的材料量。
    2、DNA样本:体积≥20ul,浓度≥100ng/ul,DNA总量≥2ug,20℃保存,低温冰袋运输。
    3、血液样本:要求保存于抗凝管中或冻存管中,体积大于2ml,请用干冰运送,保证DNA不降解。
    4、样品为石蜡包埋组织切片的,要求提供10张组织切片光片(面积>10mm×10mm,厚度约5-10um)。

 

 

 

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