实时荧光定量检测

    荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程。随着 PCR 反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,结合相应的软件可以对产物进行分析,从而得到一条荧光扩增曲线,计算待测样品的初始模版。实时荧光定量PCR技术是一次由DNA定量技术的飞跃。运用该项技术,我们可以对DNA 、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。

 

 

编号 服务名称 内容说明 周 期 价    格
UBL401 qPCR—引物设计 引物设计 2工作日 300元/对
UBL402 qPCR—构建标准品 用于绝对定量的标准品   1000元/个
UBL403 qPCR—标准曲线制备 用浓度梯度标准品进行定量,计算得到标准曲线   600元/条
UBL404 qPCR—相对定量 每个样品重复三次,内参重复三次,包含反转录、引物合成费用、内参基因费用 4-8周 询价
UBL405 qPCR—绝对定量 含标准品、标曲等 4-8周 询价

 

 

成功案例:

    中国农业科学院果树研究所、中国林业科学院森环森保所、CDC营养安全所、湘雅医院、中国农业大学、北京大学、北京肿瘤医院、中国医学科学院基础医学研究所、首都儿研所、北京师范大学、哈尔滨工业大学、阜外医院、中国农科院植物保护研究所、北京林业大学、中国科学院微生物研究所、中国农业科学院生物技术研究所、北京农学院、山西省心血管病医院、中国科学院微生物所、军科院二院三所、301医院、北京军区总医院、国家疾控中心、306医院、蛋白质组研究中心、国家人口计生委科学技术研究所、CDC职业卫生所、北京口腔医院、农科院土肥所、首都医科大学附属北京友谊医院、动物所、中国医科大学附属盛京医院、北京化工大学、聊城人民医院、吉林大学第一医院、湘雅医院、天津医科大学、中国林业科学院森环森保所、解放军第一医院附属医院、北医三院、农科院蜜蜂所、解放军总医院、农科院植保所蝗虫组、北京协和医院、中国农业科学与果树研究所、山东大学、北京大学医学部、北京体育大学、北京口腔医院、301医院骨科、大连医科大学、吉林大学第一医院等。

 

常见问题:
Q: 如何选择合适的内参基因?

A:常见物种做mRNA使用actin做内参,miRNA检测使用U6做内参,特殊物种根据文献选择合适的内参。对于一些无法确定内参的物种,我们可以提供内参基因筛选服务,选出稳定的内参用于后续实验。

 

Q: 引物出现非特异怎么解决?

A:提高退火温度;减少引物量;重新设计引物。

 

Q: 绝对定量与相对定量有什么区别?

A:绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线。相对定量实验有两种方法:标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法,可以使用绝对标准品,也可以使用相对标准品,而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品,典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。

 

Q: 每个反应管中可以加入多少种探针?

A:每个反应管中可以加入的探针数目,取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。

   首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下,全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制的。如果信号的采集要通过滤色片,那么探针的数量取决于滤色片的数目,增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以ABI公司的仪器为例,7900和7700是激光-全波长检测的,7000、7300是4色滤色片的,7500是5色滤色片的。

   其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起,在同一反应管内使用,必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近,既保证信号激发的效率又保证信号不重叠干扰,能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限,满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。

   第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光,占去一种荧光;TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光,对于4色检测的仪器来说,只剩下2种荧光可以标记探针,对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqMan MGB探针,由于它的淬灭基团是不发荧光的,比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高,不做ROX校正(AB公司不推荐这样做),还可以再多一种荧光用于标记探针。

   第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变,因为绝大多数人类基因是2态的,只存在两种等位基因,2条探针已经足够。如果研究基因表达,通常是两两比较居多,比如处理比未处理,正常比异常等,加上一个内对照,3色也就足够了。

   最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度,二是节省反应成本。同时测定的基因越多,成本也越低。但是加入4-5种探针,就要同时加入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰,平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的,但是要花费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大,在总体上可能反而不合算。

   在实际应用中,不是单纯追求加入的探针越多越好,而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应,引物和探针的设计不太困难,反应条件的优化也不太麻烦,同时降低了成本。

 

Q: 什么是双标准曲线法?

A:双标准曲线法是指将内参基因及目的基因分别稀释5个点,做标准曲线,以确保扩增效率,再根据绝对定量的数据计算差异表达情况。

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